大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞永生化細(xì)胞操作步驟

** 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選**

完成細(xì)胞培養(yǎng)和預(yù)處理后，將構(gòu)建好的SV40大T抗原表達(dá)質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入原代Müller細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，更換為含400μg/mL G418的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選，持續(xù)2-3周直至未轉(zhuǎn)染細(xì)胞死亡。期間需每3天更換一次篩選培養(yǎng)基，并密切觀察細(xì)胞狀態(tài)。注意設(shè)置未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為陰性對照，以確認(rèn)篩選效果。

**單克隆分離與擴(kuò)增**

采用有限稀釋法進(jìn)行單克隆分離：將篩選后的細(xì)胞懸液稀釋至0.5個(gè)細(xì)胞/100μL，接種于96孔板，每孔加入100μL培養(yǎng)基。培養(yǎng)1周后標(biāo)記單個(gè)細(xì)胞形成的克隆，待克隆長至孔底50%面積時(shí)，用克隆環(huán)法分離并轉(zhuǎn)移至24孔板擴(kuò)大培養(yǎng)。此過程需特別注意無菌操作，建議每個(gè)克隆保留3個(gè)備份。

**永生化驗(yàn)證**

通過以下方法驗(yàn)證細(xì)胞永生化特性：

1) RT-PCR檢測SV40大T抗原mRNA表達(dá)；

2) Western blot檢測大T抗原蛋白表達(dá)；

3) 連續(xù)傳代觀察：永生化細(xì)胞應(yīng)能穩(wěn)定增殖超過50代，而原代細(xì)胞通常在10代左右出現(xiàn)衰老；

4) 生長曲線測定：繪制細(xì)胞倍增時(shí)間曲線，永生化細(xì)胞應(yīng)保持穩(wěn)定增殖速率。

** 功能特性鑒定**

為確保永生化細(xì)胞保持Müller細(xì)胞特性，需進(jìn)行：

• 免疫熒光染色檢測特異性標(biāo)志物（GS、CRALBP、Vimentin）

• 合成酶活性測定

• 鉀離子緩沖功能檢測

• 對視網(wǎng)膜神經(jīng)元條件培養(yǎng)基的反應(yīng)性測試

**細(xì)胞凍存與復(fù)蘇**

鑒定合格的細(xì)胞系按1×10^6細(xì)胞/mL密度凍存于含10%DMSO的培養(yǎng)基中，程序降溫后轉(zhuǎn)入液氮保存。復(fù)蘇時(shí)采用37℃快速水浴法，離心去除凍存液后重懸于新鮮培養(yǎng)基。建議前3代細(xì)胞每代凍存5-10支備份。

**注意事項(xiàng)**

1. 所有操作需在二級生物安全柜中進(jìn)行

2. 不同批次血清需預(yù)先進(jìn)行細(xì)胞生長測試

3. 定期檢測支原體污染

4. 建議使用低代次細(xì)胞（10-30代）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

5. 原始細(xì)胞株應(yīng)分開保存避免交叉污染